本期為您推薦河南科技學院楊天佑教授團隊發表在Journal of The Science of Food and Agriculture上的一篇文章：Breeding of high-tolerance yeast by adaptive evolution and high-gravity brewing of mutant。 本研究采用優化的微生物微滴培養平臺(MMC)，對釀酒酵母進行適應性實驗室進化(ALE)，篩選得到乙醇耐受性升高的菌株。對獲得的優勢菌株進行超高濃度釀造工藝研究，表明其在超高濃度啤酒釀造中具有應用價值。
啤酒是世界上消費最廣泛的酒精飲料，近年來，越來越多的人喜歡飲用具有多種風格和口味的精釀啤酒。烈性啤酒因為其酒花含量高、風味濃郁、酒精含量高受到如中國，意大利和澳大利亞啤酒喜好者的追捧。烈性啤酒被定義為原始麥芽汁超過16°P(柏拉圖度)和酒精含量超過6.5%(v/v)的啤酒。但是超高濃度的釀造會使得釀酒酵母發酵緩慢和活力低下，其中乙醇脅迫源是影響釀造的最主要因素，因此選育高乙醇耐受性菌株成為超高濃度釀造的主要途徑。
目前提高釀酒酵母酒精耐受性的主要方法包括適應性實驗室進化(ALE)、誘變、原生質體融合，以及基因操作如基因組編輯、代謝工程和靶向基因表達調控等技術。ALE是利用生物體適應所選擇的環境條件的能力來改良菌株，而傳統的微生物培養方法操作繁瑣、產量低、效率低、耗費大量的人力和試劑，導致ALE耗時耗力。而近期基于液滴微流控技術的新型微生物培養和篩選系統，即自動高通量微生物微滴培養系統(MMC)，可以有效的解決上述傳統培養所出現的問題，為高效率的篩選乙醇耐受性酵母提供技術基礎。
研究團隊首先利用前期篩選得到的菌株YN81，在不同濃度的乙醇條件下進行培養，發現12%的乙醇存在時，酵母生長停滯，因此選取6%-12%作為適應性進化濃度范圍。在MMC中生成50個液滴體系，在50天的馴化時間內分別6%，6.6%，7.2%， 7.8%， 8.4%，9.0%，9.6% 和12%梯度添加乙醇，傳代時間設定為11 h。最后在12%濃度的乙醇條件下，有3株菌可以良好的生長，分別為1，3，45號液滴（圖1）。在300、340、380和420 g/L蔗糖的YPD培養基下，篩選菌株的生長速度均高于親本菌株YN81，其中YN81mc-8.3在420 g/L蔗糖濃度下的細胞濃度明顯高于其他菌株，顯示出較好的糖耐受性（圖2）。同時在不同濃度的乙醇脅迫下YN81mc-8.3也顯示出最好的乙醇耐受性（圖3）。
對獲得的優良菌株在遺傳穩定性，超高濃度釀造以及啤酒的口感風味方面進行分析（圖4-7）。結果顯示篩選出的菌株具有良好的遺傳穩定性，在釀造過程中的麥汁速率以及最終的乙醇含量均高于野生型。對釀造出的啤酒進行感官分析表明YN81mc-8.3生產的烈性啤酒在視覺、嗅覺和味覺特征方面有著更好的表現。這些結果顯示MMC在高濃度乙醇耐受性的釀酒酵母選育方面具有應用前景。
圖1 釀酒酵母YN81在MMC中八個不同階段的適應性進化結果
圖2 脅迫選擇后的3個菌株與野生型YN81在不同蔗糖濃度的YPD培養基中的生長曲線
圖3 脅迫選擇后的3個菌株與野生型YN81在不同乙醇濃度的YPD培養基中的生長曲線
圖4 脅迫選擇后的3個菌株與野生型YN81的遺傳穩定性
圖5 烈性啤酒釀造過程中的原麥汁和乙醇濃度變化
圖6 不同啤酒樣品的物理化學參數
圖7 不同啤酒樣品的感官分析
論文鏈接：https://doi.org/10.1002/jsfa.12959
本期為您推薦河南科技學院楊天佑教授團隊發表在Journal of The Science of Food and Agriculture上的一篇文章：Breeding of high-tolerance yeast by adaptive evolution and high-gravity brewing of mutant。 本研究采用優化的微生物微滴培養平臺(MMC)，對釀酒酵母進行適應性實驗室進化(ALE)，篩選得到乙醇耐受性升高的菌株。對獲得的優勢菌株進行超高濃度釀造工藝研究，表明其在超高濃度啤酒釀造中具有應用價值。
啤酒是世界上消費最廣泛的酒精飲料，近年來，越來越多的人喜歡飲用具有多種風格和口味的精釀啤酒。烈性啤酒因為其酒花含量高、風味濃郁、酒精含量高受到如中國，意大利和澳大利亞啤酒喜好者的追捧。烈性啤酒被定義為原始麥芽汁超過16°P(柏拉圖度)和酒精含量超過6.5%(v/v)的啤酒。但是超高濃度的釀造會使得釀酒酵母發酵緩慢和活力低下，其中乙醇脅迫源是影響釀造的最主要因素，因此選育高乙醇耐受性菌株成為超高濃度釀造的主要途徑。
目前提高釀酒酵母酒精耐受性的主要方法包括適應性實驗室進化(ALE)、誘變、原生質體融合，以及基因操作如基因組編輯、代謝工程和靶向基因表達調控等技術。ALE是利用生物體適應所選擇的環境條件的能力來改良菌株，而傳統的微生物培養方法操作繁瑣、產量低、效率低、耗費大量的人力和試劑，導致ALE耗時耗力。而近期基于液滴微流控技術的新型微生物培養和篩選系統，即自動高通量微生物微滴培養系統(MMC)，可以有效的解決上述傳統培養所出現的問題，為高效率的篩選乙醇耐受性酵母提供技術基礎。
研究團隊首先利用前期篩選得到的菌株YN81，在不同濃度的乙醇條件下進行培養，發現12%的乙醇存在時，酵母生長停滯，因此選取6%-12%作為適應性進化濃度范圍。在MMC中生成50個液滴體系，在50天的馴化時間內分別6%，6.6%，7.2%， 7.8%， 8.4%，9.0%，9.6% 和12%梯度添加乙醇，傳代時間設定為11 h。最后在12%濃度的乙醇條件下，有3株菌可以良好的生長，分別為1，3，45號液滴（圖1）。在300、340、380和420 g/L蔗糖的YPD培養基下，篩選菌株的生長速度均高于親本菌株YN81，其中YN81mc-8.3在420 g/L蔗糖濃度下的細胞濃度明顯高于其他菌株，顯示出較好的糖耐受性（圖2）。同時在不同濃度的乙醇脅迫下YN81mc-8.3也顯示出最好的乙醇耐受性（圖3）。
對獲得的優良菌株在遺傳穩定性，超高濃度釀造以及啤酒的口感風味方面進行分析（圖4-7）。結果顯示篩選出的菌株具有良好的遺傳穩定性，在釀造過程中的麥汁速率以及最終的乙醇含量均高于野生型。對釀造出的啤酒進行感官分析表明YN81mc-8.3生產的烈性啤酒在視覺、嗅覺和味覺特征方面有著更好的表現。這些結果顯示MMC在高濃度乙醇耐受性的釀酒酵母選育方面具有應用前景。
圖1 釀酒酵母YN81在MMC中八個不同階段的適應性進化結果
圖2 脅迫選擇后的3個菌株與野生型YN81在不同蔗糖濃度的YPD培養基中的生長曲線
圖3 脅迫選擇后的3個菌株與野生型YN81在不同乙醇濃度的YPD培養基中的生長曲線
圖4 脅迫選擇后的3個菌株與野生型YN81的遺傳穩定性
圖5 烈性啤酒釀造過程中的原麥汁和乙醇濃度變化
圖6 不同啤酒樣品的物理化學參數
圖7 不同啤酒樣品的感官分析
論文鏈接：https://doi.org/10.1002/jsfa.12959
